در این پست می توانید متن کامل پایان نامه تعیین ژنوتایپ ویروس هپاتیپ B در اهداء کنندگان 3 استان کرمان و یزد و اصفهان را  با فرمت ورد word دانلود نمائید:

 روش اجرا

نوع مطالعه، جامعه مورد مطالعه و نمونه گیری

نوع مطالعه : توصیفی

جامعه مورد مطالعه : افراد اهداء کننده

تعریف انواع اهداء کننده :

اهداء کننده بار اول : به اهداء‌کننده‌ای گفته می‌شود که برای اولین بار مبادرت به اهداء خون کرده است.

اهداء کننده با سابقه : اهداء کننده‌ای است که سابقه یک بار اهداء خون در طی سالیان گذشته را داشته باشد.

اهداء‌ کننده مستمر : اهداء کننده‌ای است که حداقل در طی یکسال دوبار به اهدای خون مبادرت نموده است.

روش نمونه گیری : نمونه گیری بصورت تصادفی ساده می‌باشد.

روش انجام کار : برای جمع آوری اطلاعات از افرادی که جهت اهدای خون مراجعه می‌کنند از روش مصاحبه مشاهده و آزمایش استفاده می‌شود و نمونه افرادی که HDSAG آنها باشد جهت مطالعه انتخاب می‌شود. ابتدا بر روی نمونه‌ها عمل استخراج DNA ویروس ؟ B انجام می‌پذیرد سپس با استفاده از پرایمر اختصاصی جهت ژن B و با استفاده از روش mested PCR ژنP تکثیر می‌شود آنگاه محصول PCR تعیین توالی می‌شود.

نحوه اجرای تحقیق : مطالعه انجام شده یک مطالعه قطعی می‌باشد که بر روی اهداء کنندگان خون 3 پایگاه یزد، اصفهان و کرمان انجام می‌شود به هنگام نمونه گیری از هر یک از اهداء کنندگان خون درخواست شد تا پرسش نامه‌ای را تکمیل نمایند کلیه مشخصات اهداء کنندگان شامل نام و نام خانوادگی، سن و جنس و تحصیلات و دفعات اهداء خون و عوامل و غیره‌ ثبت و ضبط شده باشد (پرسشنامه صفحه بعد) و 120 نمونه خون HBSAG جهت مطالعه جمع آوری شد.

هدف تحقیق :

هدف اصلی این مطالعه تعیین ژنوتایپ ویروس هپاتیپ B در اهداء کنندگان 3 استان کرمان، یزد و اصفهان است.

برنامه آنالیز آماری که بر روی اطلاعات خام انجام گرفته است:

در این پژوهش پس از تعیین داده‌های خام بدست آمده و وارد کردن آنها به کامپیوتر و افزودن نتایج حاصل از آزمایشات انجام شده به آنها با استفاده از برنامه از نوشته شده (SPSS) جداول توصیفی گردیده‌اند برای تعیین ارتباط (معنا دار بودن) از آزمون cha square یا xf استفاده شد فرول آزمون به ترتیب زیر است :

درجه آزادی اختلاف معنا دار p<0/05 در نظر گرفته شد.

 آزمایش مولکولی :

برای تخمین ویروس هپاتیت B از روشهای سرولوژی و برای شناسایی‌اش از روش مولکولی استفاده می‌شود PCR برای شناسایی ویروس درخون روشی بسیار اختصاصی و حساس می‌باشد و حضور میزان کمی از DNA HBV ممکن است برای زمان طولانی مرسوم قابل بررسی باشد و ابزار مناسبی برای تشخیص DNA ویروس در خون مادر؛ جنین و مایع آمونیاک محسوب می‌شود به طور کلی DNA ی یکی از انواع PCR که در تعیین DNAی ویروس هپاتیت B‌نیز به کار می‌رود nested PCR است که با پرایمرهای اختصاصی در برخی مطالعات استفاده شده است علاوه بر pcr nested از Red times PCR نیز برای تشخیص DNA HBV استفاده می‌شود.

به منظور انجام PCR در ابتدا باید به DNA HBV دست یافت. بنابراین استخراج DNA صورت می‌گیرد و پس از آن PCR انجام می‌گیرد و در نهایت جهت بررسی این که DNAی HBV در نمونه مورد بررسی حضور داشته است یا خیر از روش ژل الکتروفروز استفاده می‌شود.

استخراج DNA

از کمیت استخراج اسید نوکلئیک با خلوص بالا بر روی استخراج DNA HBV استفاده می‌شود این کمیت برای خالص سازی اسید نوکلئیک ویروس از سرم، پلاسما یا خون کامل پستانداران طراحی شده است.

پوشش لیپدی سلول پستاندارد در حضور پروتئیناز K و Glanidine تخریب می‌شود اسید نوکلئیک موجود در محیط آزمایش به طور انتخابی به فیبرهای شیشه‌ای مخصوص در سلولهای حاوی فیلتر متصل می‌شوند. در نهایت پس از طی مراحل شست و شو، ترکیبات سلولی حذف می‌گردد و اسید نوکلئیک خالص در اتصال با فیلتر باقی می‌ماند. افزودن بافر رقیق کننده باعث رها شدن اسید نوکلئیک از فیلتر می‌شود.

PCR

PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلی مر از روش ساده و در عین حال ظریف است که برای تکثیر قطعه‌ای خاص از توالی DNA در شرایط آزمایشگاه کاربرد دارد. در این روش با انجام یک واکنش آنزیمی میلیون‌ها نسخه از توالی مورد نظر بدست می‌آید.

در 1971، روشی برای تکثیر یک منطقه از DNAی دو رشته‌ای با استفاده از دو آغازگر (Primer) ساختگی طراحی شده با وجود در دست بودن این مفهوم، روش استفاده مکرر از این امر برای انجام تکثیر Amplification تا 12 سال بعد، کری مولیس (kavy mullis) در بهار 1983 ، این ایده را در ذهن خود پرورش داده و در نهایت در 19910 م فرایند PCB را ابداع کرد. مطرح نشده بود مولیس در 1993 م، به خاطر این کشف موفق به دریافت جایزه نوبل گردید. روش PCR مطابق اسلوبی است که داخل هسته سلول برای برای از یاد DNA در زمان تقسیم رخ می‌دهد. در سلول زنده یک فرایند پیچیده ناشی از عملکرد بروتیشن‌های مختلف موجب همانند سازی ژنوم می‌گردد که در ساده ترین تعریف می‌توان گفت در همانند سازی DNA دو رشته از هم گسیخته می‌شود و هر رشته از مولکول اولیه به عنوان الگوی ساخت رشته‌ مکمل به کار می‌رود. همانند سازی در این مرحله بر اصل ارائه شده واتسون – که یک استوار است؛ اصلی که بیان میدارد نوکلئوتید A همواره با نوکلئوتیدT ، و نوکلئوتیدC با نوکلئوتید G جفت می‌شود (saiki et al 1985)

در PCR، یک سیستم بافری وجود دارد که در آن DNA پلیمر از توالی خاصی از مولکول DNA را تکثیر می‌دهد. در این سیستم اکسی نوکلئوتیدها به عنوان واحدهای ساختمانی برای ساخته شدن رشته جدید به کار می‌روند. در این میان پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی اختصاصی ناحیه‌ای خاص از رشته الگو را برای همانند سازی برجسته می‌سازند.

PCR سه مرحله دارد که با استفاده از تغییرات دما انجام می‌شود.

1- تقلیب (Donaturation) در این مرحله، DNA الگوی دو رشته‌ای بوسیله گرما تقلیب می‌شود. عموماً این کار در دمای ْc95 صورت می‌گیرد.

2- به هم پیوستن Annavling مخلوط واکنش تا رسیدن به دمای اتصال به سرعت سرد می‌شود و در این حالت امکان اتصال و هیبرید شدن پرایمرها را با الگو فراهم می‌آورد. در این مرحله آنزیم DNA پلی مر از مقاوم به گرما می‌تواند فرایند تکثیر را آغاز کند.

3- ساخت DNA : با توجه به دمای بهینه کارکرد آنزیم DNA پلی مر از مقاوم گرمایی، مخلوط واکنش، تا Cْ72 گرم می‌شود تا تکثیر DNA انجام شود.

مهمترین متغیرهای تاثیر گذار در اختصاصی بودن یک واکنش PCR عبارتند از دمای به هم پیوستن، برنامه و تعداد چرخه و ترکیب بافر اختصاصیت بالا در PCR با بهینه کردن موارد زیر حاصل می‌شود.

  • غلظت بهینه Mg+2 سایر یون‌ها، پرایمرها، DNTP ها وdna پلی مر از
  • تقلیب موثر، دماهای اتصال بالا و بالا بودن سرعت تغییر دما (Ramping Rate)
  • محدود کردن تعداد چرخه‌ها و طول مدت آن‌ها
  • کلایی دستگاه ترموسایکلر
  • افزودنی‌های PCR
  • کیفیت الگو
  • Nested PCR (2006 Mcpherson et al.)

 PCR Nested :

در روش PCR Nested از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود به طوری که جفت دوم در بین جفت اول جای می‌گیرد در این روش، ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف، در طول 15-30 چرخه تکثیر می‌شود که احتمال دارد به میزان دلخواه اختصاصی نباشد. سپس محصول PCR حاصل به لوله‌ای دیگر منتقل می‌شود و به عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحله دوم PCR انجام شده و ترادف کوچکتری از DNA که درون محصولPCR رولی است به اندازه 15-40 چرخه تکثیر می‌شود که خصوصیت آن، تکثیر قسمت داخلی تر یا به عبارت دیگر اختصاصی تر می‌باشد. مزایای این روش تغییر یافته PCR عبارت است از :

  • نیاز به پروپ (کاوشگر) و تأییدهای بعدی کمتر است.
  • حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است.
  • به دلیل انتقال محصول PCR دور اول به لوله جدید، ممانعت کننده‌ها رقیق می‌شود (یعنی 1386)

ژل الکتروفروز :

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   دانلود پایان نامه ارشد: نظریه سلولی

یکی از روش‌های متداول مشاهده محصولات واکنش PCR (به طور کلی DNAی دو رشته‌ای رنگ آمیزی DNA با اتیدیون برومایه و بارگذاری (LOAD) درون چاهک بر روی ژل آکارز است. آگار مخلوطی از دو پلی ساکارید آگارز و آگاروپکتین است که از چند جلبک دریایی بدست می‌آید. خاصیت ژله‌ای آگار به طور عمده بدلیل وجود آگارز است و خصوصیات نامطلوب آن در حین (الکترواسموز و کد رشدگی) از آگاروپکتین ناشی می‌شود. انواع مختلفی از آگارز را شرکت‌های سازنده تولید می‌کنند که تفاوت آن‌ها در میزان خلوص آگارز از نظر عدم حضور پلی ساکاریدهای باردار(که موجب الکترواسموز می‌شوند) درجه ذوب، قوام و میزان شفافیت است با برقراری یک جریان الکتریکی و در حضور بافر عبور دهنده جریان، قطعات DNA که دارای بار منفی هستند، بر مبنای طول خود با سرعت‌های متفاوتی در ژل آگارز حرکت می‌کنند از قطب منفی به سمت قطب مثبت می‌روند و بنابراین به تفکیک طول از یکدیگر جدا می‌شوند در این حالت اگر یک رنگ آشکار ساز مانند اتیدیوم بروماید در بافر الکتروفروز یا ژل موجود باشد در لابه‌لای بازهای DNA ی دو رشته‌ای وارد می‌شود و با استفاده از پرتوهای (ultro violet) همچنین با استفاده از یک اندازه نمای SONA (DNA sizar marker) با پله‌هایی به طول متخصص (به عنوان راهنما برای بررسی نمونه‌های آشکار شده روی ژل) می‌توان DNA را بر روی ژل مشاهده کرد.

توجه به این نکته ضروری است که قدرت تفکیک ژل در یک محدوده مشخص نسبت مستقیم با غلظت ژل دارد. بنابراین برای آشکار سازی قطعات کوچک یا در مواردی که هم زمان دو یا چند قطعه با تفاوت طول کم در یک نمونه وجود دارد که احتیاج به تفکیک بیشتر است، از ژل غلیظتر و برای قطعات بزرگتر یا در مواردی که هم زمان دو یا چند قطعه با تفاوت طول بیشتر در یک نمونه وجود دارد که احتیاج به تفکیک خیلی بالا نیست، از ژلی با غلظت کمتر استفاده می‌شود.

تعیین توالی مولکول DNA (Soguncing)

امروزه تعیین توالی DNA در زمره اندیشمندترین ابزارهایی است که در زیست شناسی ملکولی برای شناسایی و تعیین محل دقیق نوکلئوتیدها در ساختمان ژن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

نخستین بار فردریک سنگر (1974) روش تعیین توالی A را با استفاده از دی اکسی نوکلئوتیدتری فسفات‌ها و بر مبنای ساخت DNA معرفی نمود قرار گرفتن این نوکلئوتیدها که در محل 3 کلکول قند فاقد اکسیژن هستند در عین پلیمراسیون در طول زنجیره DNA موجب ختم سنتز رشته جدید می‌گردد و در صورتی که بین نوکلئوتیدهای رادیواکتیو نشاندار شده باشند می‌توان محل نوکلئوتیدها را در هر رشته متخصص نمود.

تقریباً به صورت همزمان روش دیگری برای تعیین توالی بوسیله الن ماگنتام والترگیلبرت ابداه شد که به روش شکسته شدن شیمیایی معروف است در این روش DNA در محل هر یک از نوکلئوتیدهای چهار گانه بوسیله مواد شیمیایی خاصی شکسته می‌شوند که پس از الکتروفروز محل نوکلئوتیدها در زنجیره DNA قابل خواندن خواهد بود.

با آغاز پروژه ژنوم انسان روشهای جدید و سریعتری برای تعیین توالی ماده ژنتیکی سلولها مورد نیاز بود. در نظر داشت ه باشید که محققان مجبور بودند 3 میلیون جفت باز سازنده ساختار ژنتیکی انسان را تعیین توالی کنند. با استفاده از روشهای متداول در حدود 10 سال زمان صرف میلیونها دلار برای این پروژه پیش بینی می‌شد در نتیجه محققین درصدد ابداع روش سریعتر برای تعیین توالی برآمدند. تعیین توالی اتوماتیک DNA بعنوان روش جایگزینی با سرعت و دقت بالا توسط دانشمندان بخش زیست شناسی ساختاری LBL ابداع شد که 100-50 برابر سریعتر از روشهای پیشین بود در تعیین توالی اتوماتیک نوکلئوتیدها بجای رادیواکتیو با رنگ‌های فلورسانت نشانه دار شده در حین اکترفروز قطعات بر روی ژل اکریل آمید به محلی می‌رسند که با اشعه لیزر برخورد کرده و پس از تهییج نور فلورسانت خاصی ایجاد می‌شود که بوسیله دستگاه آشکار ساز دریافت شده و به پیام الکتریکی تبدیل می‌شود این پیامها به کامپیوتر منتقل شده و تا پایان واکنش داده‌ها بصورت اتوماتیک و بوسیله نرم افزارهای ویژه پردازش شده پیکها شناسایی گردید و توالیها که بصورت فایل متنی درآمده‌اند در اختیار استفاده کنندگان قرار می‌گیرد بدست آوردن نتایج مطلوب و قابل اطمینان از تعیین توالی اتوماتیک تا حد زیادی منوط به تهیه DNA عاری از هر گونه آلودگی با غلظت مناسب می‌باشد. هر گونه آلودگی اعم از نمک، پروتئین، کربوهیدرات، پرایمرها، یا مقدار زیاد DNTP به داده‌های حاصل از تعیین توالی تاثیر می‌گذارد استفاده از کمیت‌های تجاری تهیه و تخلیص DNA که معمولاً سریع، خوب و قابل اطمینان است معمولاً برای تهیه نمونه DNA در سیستم تعیین توالی اتوماتیک پیشنهاد می‌شود.

کمیت‌های تخلیص DNA به دو روش اساسی بیوشیمیایی هستند. فیلتر سیلیکا که جدا سازی را بر حسب اندازه نمونه انجام داده و مرحله جداسازی DNA در آب صورت می‌گیرد و دیگر ستون‌های تعویض آنیونی که مرحله جداسازی DNA در حضور غلظت بالایی از نمک صورت می‌گیرد. تجربه نشان داده است که نمونه DNA تخلبص شده بافنل – کلروفرم در سیستم تعیین توالی اتوماتیک نتایج مطلوبی نمی‌دهند. استفاده از بافرهای استات پتانسیم برای تهیه نمونه DNA در سیستم تعیین توالی اتوماتیک ترجیح دارد. در صورت استفاده از ستون‌هایی که بافر جداسازی انها حاوی غلظت بالایی از نمک است می‌توانید یک مرحله اضافی رسوب دهی با الحات آمونیوم (57/757/0) اتانول مطلق 70% در دمای اتاق انجام دهید تا نمک‌های اضافی از نمونه شما حذف گردد مقدار اضافی کمک واکنش تعیین توالی را متوقف می‌نماید DNA جدا شده با بافر غلیظ نمکی از ستون و یا پس از رسوبدهی حداکثر نمک را طی شست و شو با اتانل 70% (حداقل 1 بار و حداکثر 4 بار) باید حذف نمود.

 

(ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

متن کامل را می توانید دانلود نمائید

چون فقط تکه هایی از متن پایان نامه در این صفحه درج شده (به طور نمونه)

ولی در فایل دانلودی متن کامل پایان نامه

همراه با تمام ضمائم (پیوست ها) با فرمت ورد word که قابل ویرایش و کپی کردن می باشند

موجود است

از لینک زیر می توانید دانلود کنید :

فایل ها برای اینکه حجم آنها پایینتر شود وراحتتر دانلود شوند با فرمت rar یا zip فشرده شده و پسوردگذاری شده اند. پسورد همه فایل های این سایت یکسان است.

برای دریافت پسورد فایل اینجا کلیک کنید

 دانلود متن کامل پایان نامه تعیین ژنوتایپ ویروس هپاتیپ B در اهداء کنندگان 3 استان کرمان و یزد و اصفهان

دسته‌ها: متفرقه

دیدگاهتان را بنویسید