در حساس سازی مرکزی کمک میکند. Hu و همکارانش نشان دادند که PKA و PKC جریانات A-type را در نورونهای شاخ پشتی نخاع کاهش میدهند (Hu et al., 2003). به دلیل تنوع زیاد کانالهای پتاسیمی PKA هم دارای اثر مهاری و هم تحریکی بر این کانالها میباشد ((Iskander, et al., 1995.
Ewald و همکارانش در سال ۱۹۸۵ گزارش کردند که فعالیت کانالهای پتاسیمی وابسته به کلسیم در نورون حلزون، با فسفریله شدن توسط PKA افزایش یافت (Ewald et al.,1985).
نشان داده شده است که فسفریلاسیون و بویژه فسفریلاسیون وابسته به cAMP نقش اساسی در تنظیم کانالهای کلسیمی فعال شده در ولتاژ بالا بازی میکند (Armstrong and Kalman, 1988). همچنین نشان داده شده است که فسفریلاسیون کانالهای کلسیمی HVA توسط PKA یا PKC منجر به افزایش جریانهای کلسیمی در سلولهای تحریکپذیر میشود (Yang and Tsien, 1993). Smith و Goldin در سال ۱۹۹۲ گزارش کردند که در کانالهای سدیمی مغز موش تنها فسفوریلاسیون یک ناحیه برای کاهش جریانهای سدیمی ضروری و کافی است که این کاهش جریان میتواند در نتیجه کاهش مدت زمان باز بودن کانال یا کاهش تعداد کانالهایی که قادر به باز شدن هستند باشد با این حال گزارشاتی مبنی بر افزایش جریان سدیمی توسط PKA نیز وجود دارد (Iskander, et al., 1995).
۲-۷-۲) PKC و اثر بر کانالهای یونی
خانواده PKC در مسیرهای انتقال سیگنال شرکت میکنند و اثرات بسیاری از محرکهای خارج سلولی مانند فاکتورهای رشد، هورمونها و داروها را تعدیل میکنند و هیدرولیز لیپیدها را افزایش میدهند (Jenny et al., 2005). این آنزیم برای فعالیت خود به دیآسیلگلیسرول و در برخی موارد کلسیم نیاز دارد. دیآسیلگلیسرول در نتیجه هیدرولیز برخی لیپیدها ایجاد میشود. فعالیت رسپتورهای متابوتروپیک گلوتامات نوع یک قادر به فعالسازی فسفولیپازC و در نتیجه تولید اینوزیتولتریفسفات و دی آسیلگلیسرول به واسطهی هیدرولیز فسفاتیدیلاینوزیتول میباشد (Hermans and Challiss, 2001). این آنزیم دارای چهار دمین (C1-C4) میباشد. C1 حاوی موتیفهای لازم برای اتصال به دیآسیلگلیسرول، C2 دارای نواحی شناختهشده برای اتصال لیپیدهای اسیدی و در بعضی موارد کلسیم و C3 و C4 نواحی متصلشونده به ATP وسوبسترا را تشکیل میدهند. برخی از این کینازها به دلیل فقدان C2 غیر وابسته به کلسیم میباشند .(Koya and L. King, 1998)
فعالسازی PKC با تعدیل تعدادی از کانالهای یونی مرتبط است که پتانسیل غشاء یا تحریک پذیری غشاء را تنظیم میکند (Tanaka and Nishizuka, 1994). در برخی از سلولها PKC منجر به افزایش جریانات کلسیمی وابسته به ولتاژ از طریق تغییر در ولتاژ آستانه فعالسازی به سوی پتانسیلهای غشایی منفیتر میشود (Swartz et al., 1993) و در برخی سلولهای دیگر فعالسازی PKC منجر به مهار جریانات کلسیمی میشود (Sena et al., 1995). اثر PKC بر کانالهای پتاسیمی بسته به نوع کانال و نوع سلول میتواند مهاری یا تحریکی باشد(Iskander et al., 1995). PKCفعال شده منجر به تاثیرات تعدیلی گستردهای بر تعدادی از هدایتهای یونی نورون میشود که تحریکپذیری نورونی را تعیین میکنند، این تاثیرات شامل کاهش جریانات پتاسیمی جبران کننده تاخیری (Tokimasa and Akasu, 1990) ، کاهش جریانات گابا (Krishek et al., 1994) و فعالسازی جریانات کلسیمی مختلف، AMPA یا NMDA میباشد (Swartz et al., 1993). یک مطالعه مستقیم جریانات یونی کنترل شده توسط PKC در نورونهای تنفسی بصلالنخاع وجود دارد، Champagnat و Richter نشان دادند که تزریق درون سلولی فوربول استر (phorbol ester)، یک فعالکننده PKC، نورونهای تنفسی را دپلاریزه میکند که بیانگر کاهش وابسته به PKC در کانداکتنسهای K+ مداوم است (Champagnat and Richter, 1993).
فعال سازی PKC در نورونهای هیپوکمپ باعث مهار جریانهای پتاسیمی مداوم، که شامل جریانهای پتاسیمی وابسته به کلسیم یا IK-Ca و غیر وابسته به کلسیم IK میشود(Doerner et al., 1988) ، در حالیکه در سلولهای نوروبلاست، جریانهای پتاسیمی نوع M را مهار میکنند (Malenka et al., 1986).
فعالسازی PKC توسط فوربول استر یا دیآسیل گلیسرول جریان سدیمی را در نورونهای مغز موش کاهش میدهد (Numann et al., 1991).
فصل سوم
۳- مواد و روشها
۳-۱) حیوانات
مدل آزمایشگاهی مورد استفاده در کلیه آزمایش‌ها، حلزون باغی (Caucasotachea atrolabiata) بود (شکل ۳-۱). نمونه بالغ حلزون باغی، دارای صدف بزرگی با قطر تقریبی ۳ سانتی متر، راست گرد، فشرده (طول کمتر از عرض) و دارای ۴ تا ۵ پیچ در طول صدف می‌باشند. صدف در رنگ‌های مختلف و معمولا به رنگ قهوهای تیره یا شاه بلوطی با نوارهای زرد رنگ دیده می‌شود. نمونه‌ها در شرایط مناسب از لحاظ درجه حرارت مناسب، نور و دسترسی به آب و غذا در شرایط آزمایشگاه نگهداری و با هویج، خیار و کاهو تغذیه میشدند.
شکل ۳-۱. حلزون باغی
۳-۲) تشریح و آماده سازی گانگلیون عصبی جهت ثبت
آزمایش‌ها بر روی نورون‌های مجموعه گانگلیونی تحت مری۴۶ انجام می‌گرفت (شکل ۳-۲). قبل از انجام آزمایش، بمنظور ایجاد شرایط فیزیولوژیک یکسان و حصول اطمینان از فعال بودن جانور، آن‌ها را درون ظرف آب قرار داده و پس از بیرون آمدن از صدف ابتدا صدف جانور بوسیله انبر استخوان شکن برداشته شده و سپس به کمک سوزن سر و پای حلزون بدون صدف روی چوب پنبه ثابت می‌شد. با ایجاد شکافی طولی در ناحیه گردن جانور، حلقه گانگلیونی دور مری شناسایی و از بدن خارج شده و به داخل محفظه‌ ثبت با بستر سیلگارد و حاوی رینگر نرمال حلزون منتقل و سپس با سوزن حشره در این محفظه تثبیت می‌شد. نورون‌ها در این مجموعه گانگلیونی بوسیله دو لایه بافت پیوندی احاطه شده‌اند. بخش پشتی گانگلیون دارای اعصاب کمتری بوده و با برداشتن لایههای پیوندی در این ناحیه، توسط پنس‌های بسیار ظریف در زیر استریومیکروسکوپ، نورون‌ها آشکار می‌شدند.
شکل ۳-۲. گانگلیون تحت مری تثبیت شده در محفظه ثبت
۳-۳) محلول‌ ها و داروها
محلول رینگر نرمال حلزون شامل (بر حسب میلی مولار):
NaCl (80)، (۱۰) CaCl2، MgCl2 (5)، KCl (4)، HEPES (5) و Glocuse (10) بود (Taylor, 1987) و PH آن به کمک دستگاه PH متر و با استفاده از Trisma base در حد ۴/۷ تنظیم می‌گردید.
لینالول در یخچال نگهداری ‌شده و قبل از انجام آزمایش‌ها غلظت‌های مناسب آن تهیه و در حین انجام آزمایش غلظتهای مورد نظر به محفظه ثبت سلولی افزوده می‌شد. سایر داروها شامل نیکل کلرید (مهار کننده غیر اختصاصی کانال‌های کلسیمی) و نیفدیپین۴۷ (مهار کننده کانال کلسیمی نوع L) و کلریترین (مهارکنندهی پروتئین کیناز C) و H89 (مهارکنندهی پروتئین کیناز A) میباشند که در یخچال نگهداری و مورد استفاده قرار گرفتند.
۳-۴) ثبت داخل سلولی
پتانسیل‌های عمل خودبخودی و برانگیخته در شرایط کنترل و متعاقب تیمارهای مختلف با روش تثبیت جریان با استفاده از آمپلی فایر(npi, Germany) SEC-10LX ثبت گردید. میکروالکترودهای مورد استفاده از میکروپیپت‌های دیواره نازک از جنس بروسیلیکات (USA) و با کمک یک میکروالکترود پولر افقی (Sutter Instrument, USA) تهیه می‌شد. الکترودها با محلول KCl سه مولار پر شده و نمونه‌های بدون نشت که ۵-۱ مگا اهم مقاومت داشتند جهت ثبت مورد استفاده قرار می‌گرفتند. یک سیم نقره با روکش کلرید نقره محلول داخل میکروالکترود شیشهای را به ورودی پرهآمپلی فایر وصل می‌کرد. در تمام آزمایش‌ها از یک پل آگار بعنوان الکترود مرجع استفاده می‌شد که محلول محفظهی ثبت را به پتانسیل صفر (زمین) وصل می‌کرد (شکل۳-۳).
پس از ورود الکترود به نورون، ثبت پایه برای حدود پنج دقیقه به عمل می‌آمد و درصورتی که نورون از نظر ویژگی‌های الکتریکی غشاء دارای وضعیت مناسب و پایدار بود، ثبت پتانسیل‌های غشائی در وضعیت تثبیت جریان در شرایط کنترل و متعاقب تیمارهای مختلف به عمل می‌آمد. داده‌های ثبت شده توسط یک مبدل آنالوگ-دیجیتال HEKA, Germany)) رقمی شده و به کمک نرم افزار Patchmaster ذخیره می‌گردید و انالیز دادهها با نرمافزار fitmaster انجام میشد.
شکل ۳-۳. نمایی از وسایل ثبت داخل سلولی. ولتاژ غشاء ثبت شده توسط میکروالکترود (A) به ترتیب به آمپلی فایر، مبدل آنالوگ/ دیجیتال و دیجیتال/آنالوگ (B) و نهایتاٌ به کامپیوتر (C) منتقل می‌شود.
۳-۵) مراحل آزمایش
ابتدا فعالیت خودبخودی و برانگیخته سلول با تکنیک کلمپ جریان ثبت می‌شد. پس از انجام این ثبت در هر گروه داروهای مورد نظر به محیط خارج سلولی تزریق شده و مجدداٌ در محلول جدید، فعالیت خودبخودی و برانگیخته ثبت می‌شد.
جهت بررسی و مطالعه فعالیت خودبخودی نورون‌ها در شرایط کنترل ابتدا به مدت ۵ دقیقه ثبت پایه در رینگر نرمال بعمل می‌آمد و فرکانس و ویژگی‌های اسپایک‌های خودبخودی نورون‌ها ثبت می‌شد. سپس بمنظور بررسی اثر مستقیم لینالول بر فعالیت الکتریکی سلول و نقش احتمالی آن در تحریک‌پذیری نورونی، این ماده با غلظت‌های۱/۰ و ۲/۰ میلی مولار به محفظه‌ی ثبت داخل سلولی افزوده می‌شد و همانند شرایط کنترل فعالیت خودبخودی و برانگیخته مورد مطالعه قرار می‌گرفت.
بمنظور بررسی نقش کانالهای کلسیمی در رابطه با عملکرد لینالول، از مهار کننده‌های این کانال‌ها یعنی نیکل کلرید (مهار کننده غیر اختصاصی کانال‌های کلسیمی) و نیفدیپین۴۸ (مهار کننده کانال کلسیمی نوع L) و به منظور بررسی نقش کینازها از کلریترین (مهارکنندهی پروتئین کیناز C) و H89 (مهارکنندهی پروتئین کیناز A) استفاده شد.
۳-۶) پارامترهای الکتروفیزیولوژیک مورد مطالعه
پارامترهای الکتروفیزیولوژیک مورد بررسی در این مطالعه از قرار زیر می‌باشند:
۱. پتانسیل استراحت غشاء (RMP)
۲. آستانه پتانسیل عمل (Threshold)
۳. فرکانس فعالیت الکتریکی خودبخودی
۴. طول مدت پتانسیل عمل در پتانسیل آستانه (Action potential duration)
۵. طول مدت فاصله بین پتانسیل عملها (Interspike interval)
۶. سطح زیر منحنی پتانسیل عمل (Integral)
۷. دامنه‌ی پتانسیل عمل (AP amplitude)
۸. دامنه ولتاژ پتانسیل متعاقب هیپرپلاریزان (AHP49)
۹. طول مدت دوره AHP (AHP Duration)
۱۰. شیب فاز دپلاریزاسیون و رپلاریزاسیون پتانسیل عمل (D slope& Rslope)
۱۱. فرکانس پتانسیل عمل در حین تزریق جریان مثبت
۱۲. دوره مهار فعالیت متعاقب تحریک۵۰(PSIP)
۱۳. مقاومت ورودی سلول (input resistance)
شکل ۳-۴. نحوه اندازه گیری برخی پارامترهای پتانسیل عمل
۳-۷) آزمون آماری
اندازهگیری پارامترهای مورد نظر فعالیتهای الکتریکی ثبت شده به کمک نرم افزار Fitmaster انجام شد و بمنظور مقایسه داده‌ها از آزمون آماری Repeated measure و

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منابع پایان نامه درموردارزش ویژه، ارزش ویژه برند، بازاریابی، وفاداری به برند
دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید